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一山怎能容二虎?色譜雙峰

更新時間:2022-06-23 點(diǎn)擊次數(shù):1495

俗話說的好,一山怎能容二虎?在我們?nèi)粘?shí)驗(yàn)時,這個道理也同樣適用。有實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)的小伙伴都知道,在HPLC分析中,如果色譜柱性能正常,樣品濃度適宜,分析方法合適,色譜峰在出峰時間較短的條件下,峰型應(yīng)對稱而尖銳,如下圖1所示。 

 

微信截圖_20220623085840.png

(圖1)

但在實(shí)際操作中,如果對樣品不了解,前處理不恰當(dāng)或者分析方法不合理等,會出現(xiàn)峰形不正常的情況,其中雙峰現(xiàn)象就是液相色譜中常見的問題之一,如下圖2所示。色譜雙峰指的是明明是同一種物質(zhì),但在色譜圖中卻呈現(xiàn)雙峰,讓實(shí)驗(yàn)人員誤認(rèn)為含有兩種物質(zhì),從而影響判斷。

微信截圖_20220623085849.png

(圖2)

 

 

 

一般出現(xiàn)色譜雙峰的時候,

我們可以從以下幾種原因排查

1

接頭連接不正確

如果色譜柱在使用過程中發(fā)現(xiàn)每個峰的峰形都出現(xiàn)問題,先考察是否有連接問題。管線可能太長或太短,這種情況可能導(dǎo)致滲漏或峰分叉/拖尾。如果管線太長,密封圈位置不當(dāng),將發(fā)生滲漏。如果管線推出的距離不夠,將會產(chǎn)生一段死空間,形成混合腔,導(dǎo)致柱外體積,使峰形變壞。

2

色譜柱

如果在樣品分析時發(fā)現(xiàn)每個色譜峰都有雙峰出現(xiàn),尤其在采用單一純物質(zhì)時,所有的接頭都是正常連接,則可以確定是色譜柱出現(xiàn)問題了,一般是柱頭受損或者柱頭固定相污染引起的。

如果進(jìn)樣量少,原來色譜柱正常,色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰,不一定拖尾,這一般應(yīng)是柱頭受堵,將色譜柱反過來接,用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑,將堵在柱頭的殘留物沖掉,再反過來,一般情況下就行了。當(dāng)然不反沖,正沖有時也會正常的。

如果峰拖尾,雙峰強(qiáng)弱相差不大,柱頭固定相變臟或流失可能性更大,建議按照說明書進(jìn)行日常或異常的再生沖洗。如果沖洗無法改善出峰情況,建議聯(lián)系色譜柱廠商進(jìn)行排查或維修。

3

保護(hù)柱失效

如果樣品基質(zhì)比較臟,使用一段時間之后,發(fā)現(xiàn)的峰分叉或拖尾等問題,很有可能是保護(hù)柱失效造成的。一般粗略判斷標(biāo)準(zhǔn),塔板數(shù)、壓力或分離度的改變超過10%,就需要更換保護(hù)柱了。保護(hù)柱是消耗品,建議直接更換,不需要再生。 

4

進(jìn)樣量

當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑,如純甲醇、純乙腈,純乙醇,而分析體系中以水為主時,如果樣品進(jìn)樣量大,如定量管為20μL,此時單一的純物質(zhì)會出現(xiàn)雙峰,第二峰比第一峰小(每次都不太一樣),且拖尾,保留時間會提前相對進(jìn)樣量少而言,將進(jìn)樣量減少一半以上,峰型將變?yōu)檎!_@是樣品的溶劑與流動相極性相差太大,而流動相來不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的溶劑效應(yīng)問題,該情況的異常建議用流動相作為稀釋劑或減少進(jìn)樣量以消除溶劑效應(yīng)。

另一個原因是,進(jìn)樣量不一定大,但絕對量很大,色譜圖上的雙峰緊靠在一起,基本上齊高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色譜柱問題。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了,這是由于進(jìn)樣量過大,色譜柱過載造成的。

5

溶劑問題

目前HPLC分析多為反相色譜,流動相多為甲醇、乙腈、水,加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解,最佳的溶解方法是用流動相溶解。在實(shí)際分析中,有時候?yàn)榱藰悠返娜芙庑曰蚍€(wěn)定性加入了一點(diǎn)的緩沖液,緩沖液的酸堿性可能會導(dǎo)致樣品轉(zhuǎn)化,從而產(chǎn)生雙峰現(xiàn)象。此時需要更換緩沖液,調(diào)整溶劑pH值,或者用流動相配置樣品。

此外,樣品要現(xiàn)配現(xiàn)用,避免樣品溶解液的有機(jī)相比例、pH值發(fā)生變化而導(dǎo)致的溶劑效應(yīng)。

6

樣品特性

有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),存在互變異構(gòu)現(xiàn)象,而這種互變異構(gòu)體無法分開,而是以一個動態(tài)平衡存在。在色譜分析時,在一個特定的條件下(如pH值、流動相極性、溫度等,一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰,雙峰靠的很近,基本齊高,不拖尾,條件稍一變化,尤其pH,雙峰現(xiàn)象將消失。

7

pH值

體系pH值對色譜雙峰的影響出現(xiàn)在各個環(huán)節(jié)上(前面已經(jīng)提到,尤其在緩沖液流動相平衡過程中其影響更為明顯。當(dāng)連續(xù)進(jìn)樣時,受pH的連續(xù)變化影響會經(jīng)常遇到這種雙峰的情況。另外,在樣品分析時,流動相的pH盡量遠(yuǎn)離被分析物的等電點(diǎn),否則也容易引起雙峰的產(chǎn)生。在用離子對試劑分析時,選擇不好條件也會容易引起雙峰的產(chǎn)生。

如果以上幾方面均無法幫您排除色譜實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)雙頭峰的問題,您可以聯(lián)系月旭科技售后技術(shù)支持團(tuán)隊。

 

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